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PDS-1000台式基因枪操作流程
发表日期:2012-06-29

一.PDS-1000台式基因枪操作快速指南(在使用基因枪操作前,建议首先不使用微载体和靶细胞进行一次“dry run”,测试基因枪的气体通路一切正常后再进行实验)

轰击前的准备工作

1.实验前清洗与灭菌(高压蒸汽灭菌)处理:破裂盘固定帽、微载体组件、载体膜及载体膜支架、终止屏

2.采用70%乙醇对PDS-1000台式基因枪腔体进行灭菌处理并晾干。

注意:不要对腔体进行高压蒸气或加热等灭菌处理,这样会毁坏PDS-1000台式基因枪

3.洗涤微载体并储存于50%的甘油,具体洗涤步骤如下(按下面步骤得到的微载体可进行120次轰击实验,每次轰击使用约500ug的微载体)

a)  称取30mg微载体,将其放入1.5ml的离心管内

b)  在离心管内加入1ml 70%乙醇

c)  在涡旋混合器上充分震荡3~5分钟

d)  震荡结束后静置15分钟

e)  将上述含有微载体的70%乙醇溶液离心约5秒钟,弃上清

f)   在得到的微载体沉淀中加入1ml蒸馏水

g) 充分震荡1分钟

h) 震荡结束后静置1分钟

i)   将上述含有微载体的水溶液大致离心后弃上清,再重复f~i的步骤2次

j)   在得到的微载体沉淀中加入500ul经灭菌的50%甘油(如忽略上述洗涤步骤中的损耗,微载体的浓度为60mg/ml)

        注意:a)上述制备得到的微载体甘油溶液在室温下可保存2周;b)如为钨粉载体,建议在-20°C条件下储存避免氧化,而金粉载体可在4°C或室温下储存

4.在实验的当天用外源DNA分子包埋微载体,具体包埋步骤如下(按下面步骤得到的微载体可进行6次轰击实验,每次轰击使用约500ug的微载体)

a)从上述微载体储存溶液中吸取50ul(3mg)的微载体加入1.5ml的离心管内

注意:从微载体储存溶液中吸取微载体时,需将微载体储存管放置在涡旋混合器上持续地、充分的震荡,因为这样才能避免微载体之间形成聚合体从而使DNA均匀地包埋在微载体的表面

b)加入5ul DNA(1ug/ul)

c)加入50ul 2.5M CaCl2

d)加入20ul 0.1M 亚精胺,持续震荡2~3分钟

e)震荡结束后静置1分钟后离心约2秒钟,弃上清

f)在得到的沉淀中加入140ul 70%乙醇(HPLC级或分光光度计级),离心弃上清

g)在得到的沉淀中加入140ul 100%乙醇,离心弃上清

h)在得到的沉淀中加入48ul 100%乙醇,轻轻地拍打离心管管壁数次后,在低速的混合器上充分震荡2~3秒钟

5.将包埋得到的微载体放置于载体膜(Macrocarrier)及载体膜支架(Macrocarrier Holder)。首先准备一个带盖的经灭菌处理的60mm组织培养皿,在其底部铺上一层CaCl2作为干燥剂,并在CaCl2上放一张滤纸;然后将载体膜及载体膜支架放在滤纸上,不锈钢的载体膜支架与滤纸接触而载体膜向上;最后用微量移液器吸取6ul(约500ug的微载体)经包埋处理的微载体水平地涂在载体膜中央直径约1cm的范围内,完成铺涂后立刻盖上组织培养皿的盖子约10分钟,使乙醇挥发。(具体操作如下图所示)

注意:a)为确保实验结果建议使用最新包埋好的微载体;b)上述操作需在一个平稳的工作台上进行以避免震动引起微载体互相凝结;c)在吸取微载体时还需将经包埋处理的微载体储存液放置在涡旋震荡器上;d)上述操作制备得到的载体膜及载体膜支架在2小时后即不能使用,需重新制备。

6.将破裂盘放置到位。首先用经过灭菌处理的镊子取出破裂盘并在70%异丙醇液体内轻蘸几下进行灭菌;然后将上述处于湿润状态的破裂盘放置在破裂盘固定帽内;最后将上述含有破裂盘的破裂盘固定帽连接到基因枪腔体内的氦气气体加速管(gas acceleration tube)上,并用扳手拧紧。(具体操作如下图所示)

注意:a)取破裂盘必须使用经过灭菌处理的镊子,因为油脂、指纹以及手套上的粉末都会造成破裂盘与破裂盘固定帽之间不能紧密结合从而导致漏气;b)在对破裂盘进行灭菌处理时不要将破裂盘长时间的浸在70%异丙醇内,否则会造成破裂盘的脱层;c)当破裂盘固定帽内没有放入破裂盘时不要与氦气气体加速管拧紧,避免二者的金属表面由于刮擦而引起漏气;d)不能对破裂盘进行高压蒸汽灭菌

 

 

7.根据具体的实验条件调节破裂盘和载体膜之间的位置,最后放置终止屏

注意:在进行轰击前确认在微载体组件内放置了终止屏,否则靶细胞会由于高速的微载体和载体膜而受到损伤

8.检查氦气瓶的压力,氦气瓶的压力需要超过具体破裂盘对应压力200 psi(如使用900 psi规格的破裂盘,那么氦气瓶的指示压力必须为1100 psi)

9.将待转染的靶细胞或组织放在台式基因枪腔体内特定的位置上,关门

轰击的流程

1.确认PDS-1000台式基因枪电源线连接完好,按下红色的“Power Switch ON/OFF”键开机

2.按下“Vac/Vent/Hold Switch”键设置在VAC档位对台式基因枪腔体抽真空,并维持在特定的真空度水平上(真空度至少为5英寸高的水银汞柱),达到最低的真空度时最右面的“Fire Switch”键的指示灯会闪烁。当达到设定的真空度时,迅速地将“Vac/Vent/Hold Switch”键设置在HOLD档位维持该真空度

3.按住“Fire Switch”键直到破裂盘破裂、氦气压力表显示为零才释放“Fire”键(具体操作如下图所示)

注意:a)在破裂盘破裂前释放“Fire Switch”键实验失败;b)在破裂盘破裂后长时间不释放“Fire Switch”键导致氦气的浪费;c)破裂盘破裂时会有轻微的响声,此时观察台式基因枪上方的氦气压力表就可以知道破裂盘破裂所需的具体压力;d)当压力达到设定值的90%左右时,破裂盘破裂所需的时间大致为11~13秒。

轰击后仪器的维护

1.按下“Vac/Vent/Hold Switch”键设置在VENT档位停止对台式基因枪腔体抽真空;

2.当台式基因枪真空度显示为0时打开腔体门将实验细胞或组织从腔体内取出;

3.将微载体组件(microcarry launch assembly)拿下,丢弃载体膜及终止屏;

4.取下破裂盘固定帽(rupture disks retaining cap)上使用后的破裂盘(rupture disks);

5.关闭氦气瓶阀门。

 

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